細胞計數儀驗證

1．細胞計數儀概述

細胞計數儀是用來進行細胞濃度檢測的儀器，目的是為了明確培養的細胞在某一時間段的密度，及時補充營養液，以便其能夠良好生長，一般以每毫升細胞數（細胞/ml）來表示計數結果。那么這就需要測量死細胞和活細胞的濃度，在細胞中，細胞死亡是正常的，總細胞數中活細胞所占的百分比稱為細胞活力，也可叫做存活率。對細胞活力的應用可用于對復蘇后細胞凍存和復蘇效果的檢測，也可用于在組織中對細胞進行分離時是否存在損傷的檢測。現在常用的對細胞死活的辨別方法是通過使用臺盼藍，臺盼藍染色的原理是活細胞不會被染色，而死細胞能夠染色，另一個是熒光染色法來鑒別。細胞計數儀有兩個重要的功能，一個是計數，另一個就是對細胞是否死亡的判斷。目前市場上有兩類細胞計數儀：一類是明場細胞計數儀僅需簡單的臺盼藍染色，另一類是熒光場細胞計數儀，需要相應的熒光染料。

2．細胞計數儀的原理

(1)   臺盼藍染色原理（明場細胞計數儀）：臺盼藍是細胞跨膜染料，活細胞膜結構完整，臺盼藍無法通過，細胞呈中心透亮具有明顯的輪廓。死細胞膜通透性改變，臺盼藍可跨過死細胞膜進入細胞內，使細胞顏色加深，呈現實心的圓點與活細胞中心透亮輪廓清晰有明顯的差異，根據這種形態的差異可以明顯區別活細胞和死細胞進行區別計數。

(2)  AO/PI 熒光染色原理（暗場細胞計數儀）：AO/PI 為細胞核染料，AO 為吖啶橙是一種小分子染料，可以跨過所有細胞膜進入細胞內，使有核細胞標記上綠色熒光。PI 是碘化丙啶一種大分子染料，只有細胞死亡膜通透性改變后才能跨膜進入細胞內，使死細胞的核標記上紅色熒光。AO/PI 染細胞后，死細胞會同時染上 AO 和 PI，AO 的發射光波長 532 nm 左右，PI 的激發光波長剛好與 AO 發射光波長相重，兩種染料同染上死細胞核時會發生熒光共振能量轉移，AO 的發射光被 PI 吸收，所以死細胞只會顯示紅色熒光，而活細胞只有綠色熒光。因此，通過特異性染色的細胞上標記的紅色熒光和綠色熒光就可以快速辨別出死細胞和活細胞。

注：AO/PI試劑由可以發出綠色熒光的DNA結合染料吖啶橙（AcridineOrange，簡稱AO）和可以發出紅色熒光的DNA結合染料碘化丙啶（Propidiumiodide，簡稱PI）組成。

3．為什么細胞計數儀要做驗證呢？

首先應該明確做驗證的目的，就是為了保證使用的儀器檢測出的結果數據準確、可信。細胞計數儀是用來檢測細胞數目的儀器，對其準確度要求很高，比如它的重復復現結果的能力、穩定性等等。新儀器使用前以及儀器使用一段時間后都需要對其進行驗證，保證檢測細胞數目的結果準確、可信，就必須對它的安裝、環境等各部分系統要求進行驗證，以證明該儀器符合檢測的目的和要求，產生的誤差也在規定范圍內。那么儀器驗證就是對儀器各功能進行檢測、驗證使其滿足使用者的要求。這就需要通過設計合理的預試驗來驗證該儀器是否符合檢測樣品的規定要求，復現性怎么樣、準確度會不會有偏移，結果是否可信等。所以儀器驗證就是為了保證所檢測出的結果是否可信、準確，這是很有必要的，只有經過驗證的儀器，確保該儀器各部分都在良好的情況下才能用于細胞數目的檢測。

4．細胞計數儀驗證項目

（1）安裝確認

a.文件確認

b.附件確認

c.安裝環境確認

d.安裝情況確認

（2）運行功能確認

a.運行功能確認

b.軟件控制功能測試

（3）性能確認

a. 準確度測試

b. 線性關系測試

c. 重復性測試

d. 細胞活率判定測試

5．注意事項

(1 ) 每次使用前檢查檢出室或檢出器細孔是否被污染，檢出器細孔是否被損壞，細胞計數定量隔膜泵和檢出器之間的管道是否堵塞等；

(2) 取樣計數前，充分混勻細胞懸液，使分散成單個細胞；

(3)  如果感覺細胞數量較多時，可以從細胞懸液中吸取10μL至100μL，用少量PBS稀釋后再作計數；

(4) 上機前注意檢查是否有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中；

(5) 所用的稀釋器、吸樣管要經過校準；

(6) 檢測前試樣混勻很重要，如果無旋轉式混勻器應顛倒混勻至少8次；

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